摘要

作者：Wolfgang Becker, Julius Heitz, Lukas Braun, Axel Bergmann, Becker & Hickl GmbH

FLIM图像的Z-Stack扫描通常仅记录有限数量的Z轴平面和X和y上有限数量的像素。由于光诱导荧光参数的变化甚至样品中的光损伤，无法记录更高的空间分辨率。然而，对样品曝光的详细观察表明，对于Z-Stack扫描较大的物体，如小型生物或组织样本，这并不一定正确。在这里，我们展示了一个物体的高分辨率Z-Stack成像，x20显微镜镜头填充的视野是TCSPC FLIM系统的范围内的。利用Becker & Hickl DCS-120共聚焦FLIM系统的现有功能，我们演示了家蝇(Musca domestica)的Z-Stack成像，该成像具有289个Z轴层切平面，Z阶跃宽度为2.5µm, x和Y方向为1024 x 1024像素，时间上为1024通道。利用Becker & Hickl SPCImage NG的批处理函数进行双指数衰减分析。ImageJ / FIJI基于SPCImage结果进行三维重建。

研究背景

记录Z-Stack图像，或“Z轴扫描”已经很早就被引入共聚焦和多光子激光扫描显微镜[7]。显微镜扫描一个图像平面，保存图像数据，改变焦点深度，扫描另一个平面。该过程继续进行，直到所需的平面数量已被扫描，见图1。理想情况下，足够多的紧密间隔的z平面将被扫描，以允许重建样品的三维结构。

图1:Z-Stack记录原理

虽然Z-Stack记录是激光扫描显微镜中常见的一种方法，但它与FLIM的结合使用还没有引起太多的关注。原因之一是FLIM通常侧重于分子成像，较少关注样品空间结构的重建。

分子成像必须检测荧光寿命的微小变化，通常与双指数和三重指数衰减分析相结合[1]。主要信息通常在衰减分量的振幅或寿命中，而不是在衰减函数的表观寿命中。从单个像素的衰减曲线中获得这些信息需要大量的光子[4,6]。记录这些光子不仅需要时间，而且对样品的光稳定性也有严格的要求。对于纯粹的空间成像，适度的光漂白仍然是可以接受的。然而，在FLIM中，光漂白引起寿命变化，这使得不可能从数据中获得分子信息。因此，到目前为止，FLIM Z Stack只记录了中等数量的平面。这些数据被用来寻找最有希望进行进一步衰变分析的平面。

那么，是否可以用足够多的平面来记录Z-Stack FLIM，以重建样品的3D结构?在衍射极限的X-Y-Z分辨率下，单细胞的3D成像选择当然是黯淡的。小体积内的能量浓度太高，细胞无法存活。然而，如果感兴趣的对象更大，则选择要好得多。考虑一个直径和厚度为10微米的细胞。体积为10- 6mm³。与此相比，一个物体的体积完全填满了x20显微镜镜头的视野。

视场的直径约为1毫米。在图像区域上，深度范围为0.1mm的Z叠加覆盖了0.1 mm³的成像体积。这是细胞体积的10万倍!随着能量分布在更大的体积上，平均能量密度大大降低，光漂白和光损伤效应也是如此。因此，中等大小物体的高分辨率Z-Stack应该在一个好的FLIM系统的范围内。

FLIM系统

为了验证这一假设，我们使用了Becker & Hickl DCS-120 (bh)共聚焦FLIM系统[2,3]。DCS-120有两个405 nm和488 nm的皮秒二极管激光器，一个双通道共聚焦扫描头，可选择滤光片和针孔尺寸，连接到蔡司Axio Observer显微镜，两个HPM-100-40混合型单光子探测器，和双通道SPC-180NX TCSPC / FLIM记录电子设备。激光器、数据采集系统和显微镜由bh SPCM数据采集软件控制，数据分析由bh SPCImage NG软件进行[6]。

DCS-120系统有两种Z-Stack记录模式[1,2]。在这两种情况下，SPCM数据采集软件与Axio Observer显微镜交互。FLIM系统在当前焦平面上记录FLIM数据集，并设定采集时间，保存数据，然后命令显微镜进入下一个Z轴平面。两种模式的不同之处在于数据保存的方式。每个平面的数据既可以写入数据“Mosaic”的一个元素中，也可以保存到SPCM的标准(.sdt)数据文件中。Mosaic FLIM的优点是不浪费时间保存数据，并且可以在一次分析运行中分析所有平面的数据[1,6]。

然而，由于Mosaic的大小受到内存空间的限制，Z平面的数量是有限的。该模式下典型的z-Stack格式为16个平面(512 × 512像素× 1024时间通道)到64个平面(256 × 256像素× 256时间通道)。通过将平面保存到单独的数据文件中，可以记录无限多个平面[1]。这种“记录和保存”过程的缺点是保存数据需要时间。

实验

为了不受内存限制，我们在实验中使用了记录和保存程序。基本的系统设置参数如图2所示。记录方式为“FIFO image”，有“寿命+强度”选项，见图2左图和左图二。

“寿命+强度”意味着每像素的光子数量由并行快速计数器决定，从而避免了在高计数率下的非线性强度尺度[1,5]。289个测量周期被执行，每个周期被“自动保存”功能保存。文件名为“Musca-c0001”到“Musca-c0289”(图2左)。显微镜的控制参数如图2右二所示。通过这些设置，DCS-120系统在显微镜的绝对Z尺度上记录6047µm至6767µm的289个平面。Z轴步长为2.5µm。单个平面的扫描格式为1024 × 1024像素，1024个时间通道(图2，右)。

图2:FLIM系统的基本系统参数

测量对象为一只家蝇(家蝇，采自窗台，无需伦理审批)。激发波长为405 nm，样品平面内的激发功率约为100µW。每个平面的捕获时间为60秒。探测光路采用450nm的长通荧光滤光片。显微镜镜头为蔡司EC PLAN-NEO Fluar, M=20, NA=0.5。

实验结果

图3显示了从记录的289个平面中选择的三个平面的图像。通过SPCM的“Multi-File”视图选择图像。颜色表示寿命，由SPCM的在线寿命显示功能计算[1]。

图3:不同Z平面的三幅图像。从左到右:平面120，平面150，平面180。SPCM的在线寿命功能。

乍一看，这些图片可能并不令人印象深刻。原因是每个图像仅代表通过样本的一个薄平面切片。然而，没有面外细节可见的事实表明，DCS-120扫描头光学系统提供了近乎完美的焦外荧光抑制。

通过添加选定平面的FLIM数据，可以创建数据的垂直投影。来自所有289个平面的FLIM数据投影如图4所示。它给人的印象是Z-Stack中包含了大量的细节。可以为平面的可选范围创建类似的投影。图5显示了平面130到160和平面160到194的投影。

由于投影是通过添加平面的FLIM数据产生的，因此结果可以像来自单个记录的普通FLIM数据一样使用。特别地，它们可以发送到或导入到SPCImage NG中，并通过多指数衰减分析进行处理。通过这种方式，可以获得振幅加权寿命、衰减组分的振幅和寿命或衰减参数的比率，并以彩色编码图像显示。图6给出了一个例子。

图4:所有289个平面垂直投影成单幅FLIM图像。通过SPCM的多文件视图添加平面，通过SPCM的在线寿命功能显示图像。一阶矩分析的单指数寿命

图5:130 ~ 160平面(左)和160 ~ 194平面(右)的垂直投影。一阶矩分析的单指数寿命。寿命范围从1000 ps(红色)到4000 ps(蓝色)。

图6:130 ~ 160平面(左)和160 ~ 194平面(右)的垂直投影。使用SPCImage NG进行数据分析。拟合双指数模型，振幅加权寿命。

Image J三维图像重建

通过ImageJ的Image Stacks函数结合SPCImage NG的Batch Processing和Batch Export函数，可以获得空间结构的三维重建。步骤如下。将各平面的.sdt文件加载到SPCImage NG数据分析软件中，通过“Batch-Processing”功能进行处理[6]。该函数处理所有具有模型函数和之前选定的模型参数的文件。我们建议首先在其中一个sdt文件上执行测试运行，以确定正确的IRF，最佳模型功能以及适当的寿命和强度范围。我们还建议在GPU(图形处理单元)上运行寿命分析[6]。处理单个文件只需要几秒钟，从而使总处理时间保持在合理的范围内。

一旦启动，批处理就不需要任何用户交互。结果被写入SPCImage NG的后续.img文件中。然后通过SPCImage NG的“批量导出”功能将这些文件导出为位图文件[6]。最后，将位图文件加载到ImageJ中，并通过ImageJ的Image Stacks 3D Project例程进行组合。其结果是从可选择的视角产生了许多3D演示。

图7给出了两个例子。数据分析与双指数模型结合“不完全衰减”选项的SPCImage。颜色表示双指数衰减的振幅加权寿命tm。寿命范围为0 ~ 1250ps。

图7:两个不同视角下的三维重建图。SPCImage NG和ImageJ。颜色表示双指数衰减的平均寿命tm，寿命范围红到蓝= 0到1250ps。

总结：

光漂白和光损伤通常阻碍了单细胞或其他微米大小物体的高分辨率Z-Stack FLIM的记录。然而，对于较大的物体，对光稳定性的要求明显放宽。我们的研究结果表明，bh TCSPC FLIM系统能够记录x20显微镜镜头视场大小物体的高分辨率Z-Stack FLIM。利用Becker & Hickl DCS-120共聚焦FLIM系统的现有功能，我们记录了家蝇(Musca domestica) 289个Z轴切面，Z阶跃宽度为2.5µm, x和Y方向为1024 x 1024像素，1024时间通道。SPCM可以将所有平面或选定范围内的平面数据直接投影成单幅FLIM图像，并对结果进行SPCImage NG数据分析处理。通过SPCImage的批处理功能，可以对所有单个平面进行寿命分析。结果可以通过ImageJ / FIJI的Image Stacks功能进一步处理，提供样品时空特性的完整三维重建。

参考文献：

1.  W. Becker, The bh TCSPC handbook. 10th edition (2023), available on www.becker-hickl.com

2.  Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal and Multiphoton Scanning FLIM Systems, user handbook 9th ed. (2021). Available on www.becker-hickl.com

3.  DCS-120 Confocal and Multiphoton Scanning FLIM Systems, Overview brochure, available on www.becker-hickl.com,

4.  W. Becker, Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM Results. Education brochure, available on www.becker-hickl.com

5. Wolfgang Becker, Axel Bergmann, Markus Schubert, Stefan Smietana, Lifetime-intensity mode delivers better FLIM images. Application note, available on www.becker-hickl.com.

6.  SPCImage NG data analysis software. In: W. Becker, The bh TCSPC handbook. 10th edition (2023)

7.  J. Pawley (ed.), Handbook of biological confocal microscopy, 3rd edn., Springer (2006)

联系方式：

Wolfgang Becker

Becker & Hickl GmbH

Berlin, Germany

Nunsdorfer Ring 6-

Email: becker@becker-hickl.com