小型飞秒光纤激光器的双光子FLIM成像

摘要

作者：Wolfgang Becker, Cornelia Junghans, Lukas Braun, Becker & Hickl GmbH

Alexander Jelzow, Toptica Photonics AG

我们用Toptica Photonics AG的femtofiber smart 780激光器结合Becker & Hickl DCS-120 MP TCSPC / FLIM系统演示了双光子FLIM。激光提供飞秒脉冲在783nm，80MHz重复频率，和125mW的平均功率。我们表明，激光功率在所有常见的FLIM应用足以获得高分辨率的图像。我们展示了该系统在组织的无标记(自体荧光)成像、细胞的无标记成像、生物材料中超快荧光衰减的FLIM以及荧光团标记的细胞和组织的FLIM方面的性能。

我们最近已经证明，典型生物样品的双光子FLIM可以使用190 mW, 40 MHz飞秒光纤激光器[6]。该系统为组织、细胞和小生物的无标记FLIM提供了极好的结果。我们还表明，即使激光波长不完全对应于荧光团吸收光谱的最大值，传统标记的样品也能提供出色的FLIM数据。因此，我们很想用新的783nm，125mW的Toptica femtofiber smart 780激光器进行同样的尝试。

在实验中，我们使用了现成的FemtoFibre Smart[5]与bh DCS120 MP FLIM系统[1]和尼康TE 2000倒置显微镜相结合。荧光光子被两个bh HPM-100-40或-06探测器[2,7]通过非扫描(NDD)光束路径[1,6]连接到显微镜上。一般光学系统配置请参见[6]。数据由两台bh SPC-180NX TCSPC / FLIM模块记录[2]，并由bh SPCImage NG数据分析软件分析[3]。显微镜镜头为尼康x40 NA=1.3油浸物镜。

无标记成像

哺乳动物皮肤的NADH自体荧光图像如图1所示。样品平面上的激光功率约为5 mW，整个图像的平均计数率为3×10⁶ 每秒。

图1:猪皮肤，自体荧光，510 ~ 600 nm。1024 × 1024像素，1024个时间通道。检测范围从510 nm到600 nm，振幅加权寿命，tm。右边光标位置周围5×5像素区域的衰减曲线。

图2:猪皮肤，自体荧光，420 ~ 500 nm通道，1024 × 1024像素，1024时间通道。从520nm到600nm，双指数衰减的振幅加权寿命tm的检测。右边光标位置周围5×5像素区域的衰减曲线。

酵母细胞的FLIM图像如图3所示。在420 ~ 500 nm的检测通道中记录。样品平面内的激光功率约为5 mW。更高的功率对样品造成了直接的破坏。5mw时的计数率约为400,000 s^-1。

图3:酵母细胞，420 ~ 500 nm, 1024 × 1024像素，1024时间通道。双指数衰减的振幅加权寿命tm。右边光标位置周围3×3像素区域内的衰减曲线。

超快衰减过程

图4为蘑菇孢子的FLIM图像，这是一个典型的荧光衰减极快的例子。为了更好地解决快速衰减问题，将时间通道的个数增加到4096个通道，记录时间间隔减小到2.5 ns。在这些条件下，每个时间通道的时间是600飞秒。IRF宽度约为18 ps fwhm，这是通过使用超高速HPM-100-06探测器实现的[2,7]。激光功率约为2 mW，计数率约为350,000s^-1。在光标位置进行三指数衰减分析，平均寿命tm为33 ps，最快组件的寿命t1为9 ps。

图4:肉芽孢杆菌孢子。512 × 512像素，4096时间通道，HPM-100-06探测器。时间通道宽度为600飞秒。IRF宽度为18 ps fwhm。衰减曲线如右图所示。

用标准荧光团标记的样品

可以认为，在783 nm的固定激发波长下，系统将无法激发常用的荧光团，如DAPI, Alexa 488, Alexa 563或Mito Tracker Red。

然而，事实并非如此。即使激发波长与荧光团的吸收最大值不完全匹配，在吸收最大值的短波长一侧也总是存在吸收。此外，双光子激发的吸收光谱通常比相应的单光子光谱宽。因此，在783 nm处的吸收足以激发足够明亮的荧光，可以用TCSPC FLIM检测。常用荧光团激发的例子如图5和图6所示。

图5显示了用Alexa 488、Mito Tracker Red和DAPI标记的BPEA细胞。在DCS-120 FLIM系统的两个光谱通道中同时记录图像。样品平面上的激光功率为3mw，三个荧光团都发出了明亮的荧光。每个通道的计数率在左图中约为2秒，在右图中约为4秒。原则上，通过增加激光功率可以获得更高的计数率。然而，这会导致可见的光漂白和平均荧光寿命的变化。

图5:用Alexa 488、Mito Tracker Red和DAPI标记的BPAE细胞。样品平面功率3mw。左:510 ~ 600 nm，计数率2×10⁶ 每秒。右:400 ~ 500 nm，计数率4×10⁶每秒。

图6显示了用Alexa 488、Alexa 568和DAPI标记的小鼠肾脏切片。同样在这里，所有荧光团都获得了强烈的信号。当激光功率为3mw时，每个通道的计数率约为2x 106 s^-1。

图6:用Alexa 488、Alexa 568和DAPI标记的小鼠肾脏样本。图像同时检测在两个光谱通道，1024 × 1024像素，1024时间通道。样品平面的激发功率为3mw，每通道的计数率约为2×106 s^-1。

技术细节

显微镜物镜

激发效率和收集效率随显微镜物镜数值孔径的增大而增大。因此，建议使用尽可能大的NA的镜头。在FLIM应用中，对于大NA还有另一种说法:大于1的NA抵消了荧光衰减函数中的各向异性衰减分量[2]。因此，它避免了魔角偏振器的需要和相关的发射强度损失。在本文中，我们使用尼康x40 NA=1.3镜头进行测量。

激发光光束直径

显微镜物镜平面内的光束直径必须至少等于物镜背面孔径的大小。光束直径越小，空间分辨率越低，焦体积越大，激发效率越低。最好的分辨率不是像一般人认为的那样，用高斯光束填充透镜光圈，而是在整个直径上均匀地照射它。这只能通过过度照明来实现。过度照明还有一个优点，即扫描过程中的轻微移动不会导致光束离开光圈。这减少了经常遇到的强度向场的边缘下降。为了获得均匀的后孔径照明，激光束在DCS-120扫描头前扩展了两倍。尼康x40 NA=1.3镜头的后光圈被过度照明了两倍。由此产生的激发功率损失约为四倍。

激发功率

当显微镜物镜的过照度为2倍时，样品平面上的最大功率约为16 mW。事实证明，这对所有被研究的样本来说都是绝对足够的。对于大多数样品来说，在没有严重光漂白或光损伤的情况下，可以使用的最大功率约为5mw。因此，两个过照度因子被认为是分辨率和功率储备之间的最佳折衷。有趣的是，样品平面所需的激光功率并不高于甚至低于使用femtofiber PRO近红外激光器的早期实验[6]。

这是令人惊讶的:femtofiber smart 780的重复频率为80 MHz，而femtofiber smart 780的重复频率为40 MHz。这意味着对于给定的平均功率，它只有峰值功率的1/2，因此应该产生一半的激发效率。事实并非如此，这意味着要么femtofiber smart 780的脉冲宽度更小，要么光束质量更好。

像素数

除蘑菇孢子以512 × 15像素记录外，其余图像均以1024 × 1024像素格式记录。对于FLIM的标准来说，这些像素数可能显得非常高。过去，大多数FLIM结果记录为256 x 256像素，直到最近才将默认格式增加到512 x 512像素。然而，1024 × 1024像素似乎是必要的，以充分利用光学系统的空间分辨率。每像素光子数的减少不再重要，因为它可以通过寿命分析中的重叠分束来补偿[9]。

数据采集时间

由于在我们的记录中使用了高像素数，所呈现的图像的获取时间并不短。

这部分是由于需要大量的光子来用合理数量的光子填充所有像素，部分是为了获得没有可见光子噪声的完美图像。

采集时间与像素数成线性关系。因此，256 × 256像素图像的采集时间仅为1024 × 1024像素图像的1/16，即可达到相同的寿命精度。相应的采集时间为8 ~ 12秒，中等质量的图像甚至更短。

总结：

将bh DCS-120 MP FLIM系统与Toptica femtofiber smart激光器相结合，可以实现低成本、小尺寸的多光子FLIM系统。该系统能够在所有常用的FLIM应用中记录高质量的FLIM数据。由于其体积小且能够记录无标记(NADH)图像，它似乎特别适合于医院的代谢FLIM应用[2,8]。

参考文献：

1.Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal and Multiphoton Scanning FLIM Systems, user handbook 9th ed. (2021). Available on www.becker-hickl.com

2.W. Becker, The bh TCSPC handbook. 10th edition (2023), available on www.becker-hickl.com

3.SPCImage NG data analysis software. In: W. Becker, The bh TCSPC handbook. 10th edition (2023)

4. Overview brochure, available on www.becker-hickl.com

5.FemtoFiber smart compact and efficient fiber seed lasers. www.toptica.com/products/ps-fs-fiber-lasers/femtofiber-smart

6.W. Becker, C. Junghans, H. Netz, Two-Photon FLIM with a Femtosecond Fibre Laser. Application note, available on www.becker-hickl.com

7. Becker & Hickl GmbH, Sub-20ps IRF Width from Hybrid Detectors and MCP-PMTs. Application note, available on www.becker-hickl.com

8.W. Becker, R. Suarez-Ibarrola, A. Miernik, L. Braun, Metabolic Imaging by Simultaneous FLIM of NAD(P)H and FAD. Current Directions in Biomedical Engineering 5(1), 1-3 (2019)

9.W. Becker, Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM Results. Education brochure, available on www.becker-hickl.com