基于 GPU 的 TCSPC FLIM 数据快速全局拟合

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作者：W. Becker, A. Bergmann, Becker & Hickl GmbH

摘要：

全局拟合假设多指数衰减的寿命中的一个或多个在 FLIM 图像的所有像素中都是恒定的。通过利用这种先验知识，可以比所有衰减参数浮动的多指数拟合更准确地获得衰减参数。但是，全局拟合需要大量的计算。因此，使用标准 CPU 处理的时间长得令人无法接受。我们提出了一种基于 GPU 处理的全局拟合算法，将计算时间从之前的数小时缩短到几分钟甚至更短。在这里，我们展示了全局拟合对 FLIM-FRET 分析和代谢 FLIM 分析的性能。全局拟合可在 Becker & Hickl 的 SPCImage NG 数据分析软件版本 9.073 中使用。

基于 GPU 的全局拟合程序

全局拟合假设多指数衰减的一个或多个寿命在 FLIM 图像的所有像素中都是恒定的。与需要知道组件寿命的“固定组件寿命”的拟合不同，全局拟合不需要任何寿命值的先验信息。它使用的唯一信息是一个或多个组件寿命在图像像素中不会发生变化。

恒定寿命通常出现在代谢 FLIM 数据中，其中 NADH 或 FAD / FMN 衰减函数的寿命没有或几乎没有变化，而在 FRET 数据中，非相互作用供体组分的寿命可以预期为恒定的。在这些情况下，可以预期全局拟合会改善拟合结果的信噪比。但是，全局拟合的计算量非常大：首先，使用合理的起始值执行“正常”多指数拟合。然后改变全局参数的值并执行新的图像拟合。该过程持续进行，直到整个图像的误差总和最小化。这意味着，在迭代的每个循环中，必须对整个图像进行完整的多指数衰减分析。考虑到对平均大小图像进行传统的多指数 FLIM 分析需要 5 到 10 分钟，这样的过程必须非常耗时，甚至不可能。

几年前，bh 在其 SPCImage NG 数据分析软件中引入了 GPU 处理。在 GPU 上，大量类似的计算同时执行。在 FLIM 图像中，GPU 能够并行执行数百个像素的多指数衰减拟合。因此，一幅图像的计算时间从以前的 5 到 10 分钟减少到几秒钟。一幅 FLIM 图像的计算时间为几秒钟，这使得全局分析触手可及：假设需要 20 个分析周期才能与全局参数完美拟合，则计算时间预计在几分钟或更短的量级。因此，我们在 SPCImage NG FLIM 数据分析软件中实现了基于 GPU 的全局拟合算法。FLIM-FRET 数据和代谢 FLIM 数据的结果如下所示。

SPCImage NG 中的全局适配

全局拟合在主面板右上角的衰减参数窗口中激活。所需的衰减时间定义为“全局”，并在分析中选中以进行特殊处理。请参见图 1。在图中，寿命 t3 被声明为“全局”。这意味着将确定最合适的值并将其用于所有像素。全局拟合可以使用单个全局寿命（如图所示）或两个或三个全局寿命来运行。当然，全局拟合只有与多指数衰减模型结合才有意义。没有必要为单指数拟合声明“全局”寿命。

图 1：在 SPCImage NG 中激活 Global Fit。参数 t3 被声明为“Global”。颜色代表代谢指标 a1。猪皮的 FAD 图像。

非相互作用供体的全局寿命 FRET 分析

全局拟合的一个潜在应用是 FRET 分析 [1, 3]。FRET 分析基于一个模型，该模型包含来自相互作用供体的快速衰减分量和非相互作用供体的慢速衰减分量。该技术不仅可以提供正确的经典 FRET 效率 [3]，还可以提供相互作用供体的分数、相互作用供体的 FRET 效率以及供体-受体距离。通过使用非相互作用供体的寿命作为参考寿命，该技术无需外部校准 [ 4 ]。

对双指数 FRET 分析的一个常见反对意见是需要对 FLIM 数据进行双指数拟合。双指数拟合需要比单指数拟合更多的光子。这引发了人们对拟合结果及其得出的 FRET 参数的统计准确性的担忧。我们已经证明，如果使用 SPCImage 的最大似然 (MLE) 拟合，这些担忧就没有道理 [ 2 ]。全局拟合有望进一步提高准确性：除了非 FRET 机制导致的环境变化外，非相互作用供体组分的寿命预计保持恒定。因此，具有全局非相互作用供体寿命的拟合看起来很有希望。图 2 给出了 FRET 分析与传统双指数拟合以及以非相互作用供体的寿命 t2 作为全局参数的拟合的比较。

图 2：上一行：非相互作用供体的自由寿命 t2 的 FRET 分析。从左到右：双指数衰减的平均寿命 tm、相互作用供体的量 a1、经典 FRET 效率 Eclass。彩色编码图像和参数直方图。下一行：非相互作用供体的全局寿命 t2 的 FRET 分析。从左到右：双指数衰减的平均寿命 tm、相互作用供体的量 a1、经典 FRET 效率 Eclass。彩色编码图像和参数直方图。

与经典拟合（两个寿命自由浮动）相比，全局拟合（t2 全局）的信噪比明显增加。平均而言，信噪比增加约 1.4 倍。这看起来可能不多，但它相当于对每像素光子数增加一倍的数据分析。

具有全局寿命的代谢 FLIM 分析

代谢 FLIM 使用 NADH 或 FAD 的荧光衰减函数来确定细胞或组织的代谢状态。两种化合物都以结合和未结合的形式存在。结合和未结合的 NADH 和 FAD 的量取决于代谢状态。衰减组分的荧光寿命不同，可以通过 FLIM 分离。因此，可以使用双指数衰减分析来确定代谢状态：对于 NADH，小 a1 表示氧化磷酸化，大 a1 表示糖酵解。对于 FAD 则相反：小 a1 表示糖酵解，大 a1 表示氧化磷酸化。

代谢 FLIM 的问题在于 NADH 和 FAD 荧光强度低。因此，很难获得足够的光子进行准确的双指数衰减分析。FAD 数据中存在 FNM 荧光，这使情况变得更加复杂 [ 1 , 5 ]。因此，只能通过三重指数分析获得 FAD 的定量结果。这使光子预算问题更加严重。可以通过对“固定”组分寿命进行分析来获得结果 [5]，但这容易受到操作员的主观影响。更有希望的解决方案是使用全局参数进行分析。事实证明，尽管荧光组分的寿命在不同的细胞和组织类型中有所不同，但在同一个样本中却相当稳定。这正是全局拟合有帮助的情况。

图 3 显示了一个例子。它显示了来自新鲜切除的人类膀胱组织的 FAD 数据。上行显示常规三重指数衰减分析，所有三个组分的寿命都是自由浮动的。从左到右，它显示了结合 FAD 的量 a1、未结合 FAD 的量 a2 和 FMN 的量 a3。单个像素中的光子数约为 100。为了获得合理的 a1、a2 和 a3 数据，在 SPCImage NG 中使用了 3 的分箱半径。这导致每个分箱像素大约有 5000 个光子。有关分箱过程的详细信息，请参阅 [2]。可以看出，MLE 拟合通常能够从数据中得出合理的三重指数衰减参数。然而，衰减幅度的准确性并不令人满意。

图 3从左到右：结合 FAD 的量 a1、未结合 FAD 的量 a2 和 FMN 的量 a3。上一行：标准 MLE 拟合。下一行：全局拟合，其中组分寿命 t1、t2、t3 定义为全局参数。

第二行显示了通过全局拟合获得的相同参数的图像。所有三个组分寿命 t1、t2、t3 均定义为“全局”。同样，使用了 3 的分箱半径，每个分箱像素的光子数约为 5000。对图像质量的影响是惊人的：所有组分振幅 a1、a2 和 a3 均以高精度获得，从而提供结合 FAD、未结合 FAD 和 FMN 量的清晰图像。

防范拟合中的人工制品

全局拟合要求全局参数在执行分析的整个区域内保持恒定。NADH 和 FAD FLIM 图像以及 FLIM FRET 图像通常都是这种情况。在分子成像应用中也可能出现这种情况，其中探针以结合和未结合或质子化和去质子化的形式存在。但是，应该仔细检查组件寿命是否真的恒定。对使用长采集时间和高光子数记录的参考数据进行常规分析可能有助于做出决定。

重要的是，包含非典型衰减数据的图像区域应排除在分析之外。这些区域可能是死细胞、污染点或因过度激发功率而烧毁的点。这些区域具有不同的组件寿命，因此不能使用与图像其余部分相同的全局参数集进行处理。如果已声明为“全局”的寿命进入非全局寿命范围，也会出现问题。

此外，请确保排除背景。通过 SPCImage NG 的“Threshold”参数可以轻松排除背景。排除其他污染可能需要通过相量图定义感兴趣区域或分割图像 [2]。我们还建议不要在拟合中使用超过必要数量的模型参数。全局参数的值可能并不完全适合每个单独的像素。如果模型函数过于灵活，拟合过程可能会尝试通过对剩余参数进行不必要的更改来补偿。为了获得最佳拟合精度，我们建议对“Shift”和“Offset”使用“fixed”参数。

GPU 处理的计算时间

计算时间取决于计算中使用的像素数量、时间通道数量，当然还取决于所用 GPU 的大小和速度。我们确定了笔记本电脑中 NVIDIA GPU 和标准 PC 中中型 NVIDIA GPU 的计算时间。图像包含约 80% 的有用数据像素，其余像素为背景。背景像素通过 SPCImage NG 的“Threshold”参数从拟合中排除。

	标准分析		全局分析
	3-Exponential Model		3-Exp.Model
	3组分寿命全部浮动		3组分寿命全局恒定
	256×256 像素	512×512 像素	256×256 像素	512×512 像素
	256 个时间通道	1024 个时间通道	256 个时间通道	1024 个时间通道
笔记本电脑中的小型 GPU	<1 秒	6 秒	12 秒	160 秒
PC 中的中型 GPU	<1 秒	1.2 秒	2.4 秒	32 秒

总结

全局拟合可以显著提高 FLIM 数据多指数拟合的信噪比。过去，全局拟合很少使用，因为计算时间太长。现在，BH 的 SPCImage 数据分析软件中使用的 GPU 处理将计算时间缩短到几十秒到几分钟。缩短的数据处理时间使全局拟合对许多多指数数据分析任务具有吸引力，在这些任务中，成分寿命未知但在样本内感兴趣的区域内保持不变。我们展示了 FLIM FRET 数据和代谢 FLIM 数据的全局拟合。在 FLIM FRET 数据中，全局拟合提高了从双指数衰减分析得出的 FRET 参数的准确性。在 FAD 数据中，它提供了结合和未结合 FAD 的量以及 FMN 量的定量值。