在TCSPC中，“堆积”效应发生在一个激光脉冲周期内，第二个荧光光子被激发。由于TCSPC单光子计数器电子设备仍在分析同一时间周期内的第一个光子事件，因此无法检测到第二个光子。在这种情况下，记录的荧光寿命衰减曲线与真实的荧光衰减不符。

作为一个思想实验，请想象一个典型的双光子荧光寿命成像系统（MP-FLIM）装置，配备钛：蓝宝石飞秒激光器，通常发射重复频率为80 MHz的脉冲。每脉冲发射两光子会导致计数率达到160 MHz，这极不可能。值得一提的是，这种高探测率会饱和或损坏任何已知的单光子探测器。

有趣的是，通常假设光子速率必须 < 激发脉冲速率的0.1%，以避免任何“堆积”效应。但这个假设并不正确。它可能源于对[1]中“<0.1”的“占空比”值的误解。有些数值显示了单位“%”，有些则没有。因此，“<0.1”的价值应当理解为“<10%”，而非“<0.1%”。在配备80 MHz激光器的MP-FLIM设置中，计数率为8 MHz。在这种情况下，荧光寿命误差仅发生在< 2.5%以下。这意味着FLIM技术的采集速度可比普遍认为快100倍，且“堆积”问题不严重。

堆积误差的正确大小推导及其对TCSPC FLIM无关的结论可见[2]。堆积效应误解在用户心中根深蒂固，这一点从[2]常被引用为堆积效应对TCSPC FLIM破坏性影响的证据中可见一斑。事实上，事实恰恰相反。因此，请务必在正确的语境中引用该参考文献。

 

[1] Pawley, James B., ed. 2006. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Boston, MA: Springer US. https://doi.org/10.1007/978-0-387-45524-2.[2] Becker, Wolfgang, Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. Springer 2005