恶性黑色素瘤的超快荧光寿命衰减

Wolfgang Becker, Becker & Hickl GmbH, Berlin
Vladislav Shcheslavskiy, Vadim Elagin, Privolzhskiy Research Medical University, Nizhni
Novgorod

摘要：
使用带有超快探测器的多光子TCSPC-FLIM系统，我们在多种生物材料中发现了极快的荧光寿命衰减组分。在这里，我们报告了恶性黑色素瘤的FLIM。我们发现了有寿命的衰变成分，tau1，从10 ps到20 ps，振幅为a1，高达98%。寿命和振幅与健康组织的衰变参数形成鲜明对比(tau1=185 ps，a1=55%）和来自良性色素病变的材料(tau1=96 ps，a1=45%）。

引言

通常认为生物材料的自荧光寿命在几百ps到大约5 ns之间。NADH和FAD的荧光衰变数据支持这一点，NADH的自由形式寿命约为400 ps，蛋白质结合形式寿命为3 ns，FAD的结合形式寿命约250 ps，自由形式寿命为2 ns[6，14]。其他内源性荧光团的寿命也在相同的范围内，快速衰变成分可降至约200 ps[16]。没有已知的更快的衰变时间，部分原因可能是仪器的时间分辨率有限。常用的FLIM系统具有仪器响应函数，其半宽最大值（fwhm）约为250 ps（使用PMT探测器时）和100 ps（使用GaAsP阴极混合探测器时）[1]。因此，更快的荧光衰减时间可能无法引起注意，特别是当它们作为多指数衰减的组成部分出现时。

最近，德国Becker&Hickl GmbH将超快混合探测器和超快TCSPC-FLIM模块引入其FLIM系统[1,11]。结合飞秒激光和双光子激发，该系统可提供<20 ps fwhm的IRF[1，9，10]。我们使用这些系统在各种生物样品中寻找极快的荧光衰减过程。结果令人惊讶。在蘑菇孢子[2]、花粉粒[3]、类胡萝卜素[4]甚至苏格兰威士忌[5]中发现了超快衰变成分。寿命短至10 ps，振幅大至0.99。在蘑菇孢子中，振幅和寿命与颜色密切相关[2]。在花粉和植物组织中发现了一种同等但并不严格的关系[3]。

早期有迹象表明，恶性黑色素瘤组织中也存在短的荧光寿命。Dimitrow等人[12，13]和Seidenari等人[17]发现荧光寿命缩短。由于所用仪器的时间分辨率有限，无法确定所报告的寿命是否为黑色素瘤组织的真实寿命，所产生的衰变函数是单指数还是多指数，以及哪些衰变成分是变化的来源。还存在一个悬而未决的问题，即寿命变化是由Pastore等人[15]发现的NADH结合/未结合比率的变化引起的，还是由具有极短衰变时间的荧光团的存在引起的。手头有超快速FLIM系统，因此寻找恶性黑色素瘤组织样本中的快速衰变是一个合乎逻辑的步骤。

实验

对于黑色素瘤成像，我们使用倒置（Axio Observer）型Zeiss LSM 880 NLO多光子显微镜上的bh-FLIM系统[10]。HPM-100-06混合探测器模块（Becker&Hickl GmbH）通过蔡司NDD分束器模块连接到LSM 880 NLO的NDD端口。记录电子设备由两个并联的SPC-150N时间相关单光子计数器模块和一个DCC-100探测器控制器组成（均为Becker&Hickl GmbH）。LSM 880 NLO的近红外飞秒激光的双光子吸收激发荧光，FLIM数据通过bh的多维TCSPC技术记录[1]。FLIM系统的仪器响应约为18 ps，全宽为最大值的一半[7]。这比使用GaAsP混合探测器的系统快5倍，比使用传统PMT探测器的FLIM系统快10倍。因此，快速衰变组分在衰变曲线中直接可见，而没有从比衰变时间更宽的IRF反卷积得到间接证据。

对于良性皮肤病变的成像，我们使用了基于bh DCS-120荧光寿命成像显微镜和飞秒光纤激光器的类似系统[11]。

新鲜肿瘤样本取自Institute of Transplantology, Nizhi Novgorod的肿瘤手术，并在切除后1小时内成像。使用40x NA=1.2水浸透镜。为了在样品往返的过程中获得良好的折射率匹配，将样品放置在细胞培养皿中，玻璃和样品表面之间的空间填充缓冲溶液。激发波长为750 nm，检测波长间隔为435 nm 485 nm。使用690 nm的Chroma短通滤光片滤除散射激发光。样品的背面由黑色盖子保护，以避免日光拾取，并避免荧光从聚光镜或灯反射器反射回光束路径。这种反射在衰变数据中表现为严重的失真，特别是当衰变函数包含大振幅的快速衰变分量时。

bh SPCImage NG使用MLE拟合和三指数衰减模型进行数据分析[8]。

结果

从黑色素瘤获得的FLIM结果如图1和图2所示。图1显示了通过组织的垂直截面的终身图像。浅层显示在图像的右侧，深层显示在左侧。彩色编码显示振幅加权寿命tm，通过三指数模型拟合衰变数据获得[1,8]。从图像中可以看出，在靠近组织表面的一层中，寿命非常短。浅层（橙色区域）的寿命约为20 ps，深层（绿色区域）约为1200 ps。对数据的仔细检查表明，寿命短是由于存在一个非常快的衰变成分造成的。图2显示了三指数衰减的最快分量t1的寿命。右侧显示了图像中选定点的衰减曲线。t1的短值在t1图像中清晰显示。从表面组织层看，它是衰减曲线中的一个尖峰，见右下图。对于快速组件，该拟合的寿命t1为13 ps，振幅a1为98%。振幅比a1/（a2+a3）约为57，这对于生物材料来说是异常高的。深组织层的衰减曲线中没有峰值，见右上角。这些区域的组件寿命或多或少处于“正常”范围内，并与NADH、FAD和可能的FMN的混合物兼容[6]。参数为t1=185 ps，a1=23.8%，a1/（a2+a3）=0.31。

图1：黑色素瘤样本的垂直截面，衰减数据三指数拟合的振幅加权寿命tm彩色编码图像。红色到蓝色对应0 ps到2500 ps。

图2：快速组件寿命t1的彩色编码图像，数据的三指数拟合。红色到蓝色对应于0到100 ps。图像特征点中的衰退曲线显示在右侧。

为了进行比较，图3显示了在类似条件下记录的良性色素病变样本的FLIM图像。左侧显示tm图像，右侧显示选定点的衰减曲线。从图中可以看出，没有像黑色素瘤数据那样的高振幅的超快成分。快衰变组分的寿命为96 ps，振幅为45%。振幅比a1/（a2+a3）约为0.8，即比恶性黑色素瘤小70倍。

图3：良性色素性皮肤病变样本的左：tm图像。红色到蓝色对应tm=0 ps到2500 ps。右：图像中选定点的衰减曲线。没有高振幅超快衰减分量。

结果讨论

在恶性黑色素瘤组织中测得的荧光衰减功能与正常皮肤组织和良性色素性病变组织有显著差异。最显著的差异在于快衰变分量t1的寿命和快分量的振幅比a1/（a2+a3）。衰变参数可能用于鉴别恶性黑色素瘤，并研究其发展机制。因此，超快衰变效应不再是一种特殊现象，而是一种潜在的生物信息来源。

至于快衰变成分的起源，我们只能推测。可以合理假设它来自特殊形式的黑色素。一个可能的来源是聚集物，由黑色素瘤中的高浓度黑色素形成。聚集体的荧光寿命极短并不罕见，如果黑色素也出现同样的效果，也就不足为奇了。然而，为什么其他黑色素含量高的材料没有显示出快速衰变成分仍然是一个悬而未决的问题。

参考文献

1. W. Becker, The bh TCSPC handbook. 9th edition (2021), available on
   www.becker-hickl.com

2. W. Becker, C. Junghans, A. Bergmann, Two-photon FLIM of mushroom spores reveals ultra-fast decay

component. Application note, Becker & Hickl GmbH, available on www. becker-hickl.com

3. W. Becker, T. Saeb-Gilani, C. Junghans, Two-Photon FLIM of Pollen Grains Reveals， Ultra-Fast Decay Component. Application note, Becker & Hickl GmbH, available on www. becker-hickl.com

4. W. Becker, A. Bergmann, C. Junghans, Ultra-Fast Fluorescence Decay in Natural Carotenoids. Application note, available on www. becker-hickl.com

5. W. Becker, J. Heitz, A. Bergmann, Ultra-Fast Fluorescence Decay in Scottish Whisky. Application note, Becker &Hickl GmbH, available on www. becker-hickl.com

6. W. Becker, L. Braun, DCS-120 FLIM System Detects FMN in Live Cells, application note, available on www.becker-hickl.com.

7. Becker & Hickl GmbH, Sub-20ps IRF Width from Hybrid Detectors and MCP-PMTs. Application note, available on www.becker-hickl.com

8. Becker & Hickl GmbH, SPCImage Next Generation FLIM data analysis software. Overview brochure, available on www.becker-hickl.com

9. Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal and Multiphoton Scanning FLIM Systems, user handbook 9th ed. (2021). Available on www.becker-hickl.com

10. Becker & Hickl GmbH, Modular FLIM systems for Zeiss LSM 710 / 780 / 880 family laser scanning microscopes. User handbook, 7th ed. (2017). Available on www.becker-hickl.com

11. Becker & Hickl GmbH, Two-Photon FLIM with a femtosecond fibre laser. Application
    note, available on www.becker-hickl.com

12. E. Dimitrow, I. Riemann, A. Ehlers, M. J. Koehler, J. Norgauer, P. Elsner, K.
    König, M. Kaatz, Spectral fluorescence lifetime detection and selective melanin imaging by multiphoton laser tomography for melanoma diagnosis. Experimental Dermatology 18, 509-515 (2009)

13. E. Dimitrow, M. Ziemer, M. J. Koehler, J. Norgauer, K. König, P. Elsner, M. Kaatz,
    Sensitivity and Specificity of Multiphoton Laser Tomography for In Vivo and Ex Vivo Diagnosis of Malignant Melanoma. J. Invest. Dermatol. 12(7) 1752-1758 (2009) 14. J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edn., Springer (2006)

14. M.N. Pastore, H. Studier, C.S. Bonder, M.S. Roberts, Non-invasive metabolic imaging of melanoma progression. Exp. Dermatol. 26, 607–614 (2017)

15. D. Schweitzer, S. Schenke, M. Hammer, F. Schweitzer, S. Jentsch, E. Birckner, W. Becker, Towards Metabolic Mapping of the Human Retina. Micr. Res. Tech. 70, 403-409 (2007)

16. S. Seidenari, F. Arginelli, C. Dunsby, P. M. W. French, K. König, C. Magnoni, C.
    Talbot, G. Ponti, Multiphoton

Laser Tomography and Fluorescence Lifetime Imaging of Melanoma: Morphologic Features
and Quantitative Data for Sensitive and Specific Non-Invasive Diagnostics. PLOS One, 8(7) e70682-1 to -9
(2013)

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