具有同步PH成像功能的代谢FLIM

作者：Wolfgang Becker, Cornelia Junghans, Axel Bergmann;

Becker&Hickl GmbH, Berlin, Germany

摘要：我们展示了一种将 NAD(P)H 代谢成像与 BCECF（ 2′,7′-bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein）pH 成像相结合的技术。为了激发，我们使用发射波长为 785 nm 的飞秒光纤激光器。该激光器的双光子激发以合理的效率激发 NAD(P)H 和 BCECF。两种化合物的荧光在发射端进行光谱分离，并记录在两个并行的 TCSPC FLIM 通道中。bh SPCImage 进行的分析可提供一幅显示代谢状态的图像和另一幅显示组织 pH 值的图像。

技术背景：

代谢 FLIM 基于记录辅酶 NAD(P)H 和/或 FAD 的高分辨率荧光寿命图像 [1, 3 ]。在细胞和组织中，这两种化合物以结合和非结合形式存在。结合形式和未结合形式的荧光寿命不同，可以在高质量 FLIM 数据中区分：NAD(P)H 的结合部分比未结合部分具有更长的寿命。对于 FAD 来说则相反。结合部分是快组分，未结合部分是慢组分[1]。代谢成像基于以下事实：结合/未结合比率取决于代谢状态。进行氧化磷酸化的细胞比进行糖酵解的细胞具有更低的结合/未结合比率[6]。因此，代谢的类型反映在表观荧光衰减时间中。这种简单的基于衰减时间的方法的问题在于，衰减参数的寿命还取决于其他细胞参数，例如线粒体 pH 值。因此，代谢状态的更好指标是衰减分量的振幅比 a1/a2（“代谢比”），或快速分量的振幅 a1（“代谢指标”）。详细信息请参见[1]。该方法优选的内源辅酶是 NAD(P)H，因为荧光衰减可以通过双指数衰减模型合理地描述。对于 FAD 来说情况并非如此，因为记录的信号包含 FMN [5] 的贡献。

研究发现，NAD(P)H 在细胞线粒体中的寿命受局部 pH 值的影响。因此，有人建议通过 pH 测量来补充代谢 FLIM 测量。在使用 NAD(P)H 荧光寿命的测量中，pH 可用于校正 pH 依赖性结果，在基于幅度的测量中，它提供有关细胞状态的附加信息 [7]。在此类实验中，当然希望在测量代谢状态的同时进行pH测量。这需要两个并行的 TCSPC FLIM 通道。

pH 敏感荧光团的一个很好的候选者是 BCECF（2′,7′-bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein）。我们选择它是因为它的荧光寿命对pH值依赖性比较大[8]，它可以在与NAD(P)H相同的波长下被激发，它的发射光谱与NAD(P)H的发射没有太多重叠。，且对细胞和组织无毒性作用。

FLIM系统

对于这里描述的实验，我们使用了带有飞秒光纤激光器的 Becker & Hickl DCS-120 MP 双光子 FLIM 系统 [4]。激光器的发射波长为 785 nm。该波长下的双光子激发以合理的效率激发 NAD(P)H 和 BCECF。通过非解扫描光束路径收集两种化合物的荧光，并通过二向色分光镜和滤光片进行光谱分离。通过通常的 Becker & Hickl 多维 TCSPC-FLIM 过程 [1] 将信号记录在两个并行的 TCSPC FLIM 通道中。通过我们的 FLIM 成像系统中使用的 HPM-100-40 探测器和 SPC-180NX FLIM 模块，IRF 宽度约为 85 ps，半高全宽。

结果

典型结果如图1所示。该图左侧显示NAD(P)H的寿命图像，右侧显示BCECF的寿命图像。两张图像都是通过双指数模型函数分析获得的，

振幅加权寿命t m和强度加权寿命t i为

NAD (P)H 图像显示振幅加权寿命t m，它通常用于代谢 FLIM。对于 BCECF 图像，我们使用强度加权寿命t i，因为它与 [8] 中使用的相位和幅度寿命最接近。因此，[8] 中发布的t -pH曲线也适用于图 1（右）中的 BCECF 寿命。

图 1：上排：NAD(P)H振幅加权寿命 t m，和 BCECF强度加权寿命图像。下排：光标位置处NAD(P)H的衰减函数和BCECF的衰减函数。两幅图像均为 512 x 512 像素，1024 个时间通道。使用 bh SPCImage NG、MLE 拟合进行数据分析。

图 1 使用组件寿命t 1和t 2的加权平均值来表征组织的代谢状态和 pH 值。如上所述，荧光寿命并不是表征组织的最可靠参数。表征代谢状态和 pH 的更可靠方法是使用振幅 a 1或振幅比 a 1 /a 2作为图像参数：对于 NAD(P)H，主要变化是以下分数：结合和未结合的 NAD(P)H，对于 BCECF，它是质子化和去质子化 BCECF 的分数。这意味着衰减函数的变化不是在组件寿命t 1和t 2中，而是在组分幅度 a 1 和 a 2中。当振幅用作特征参数时，结果不会受到组分寿命可能变化的影响。多年来，由于拟合过程的不稳定，FLIM 中基于幅度的方法被认为是不可能的。然而，使用 Becker & Hickl SPCImage NG 软件 [1, 2] 的 MLE 拟合，拟合不稳定不再是问题。NAD(P)H 和 BCECF 的快速衰减分量的振幅 a 1的图像如图 2 所示。可以看出，图像中没有过多噪声或拟合不稳定的迹象。

一个可能的陷阱

NAD(P)H 的激发不可避免地也会激发 FAD。FAD 的发射光谱与 BCECF 的发射光谱重叠。因此，部分 FAD 发射可以混合到来自 BCECF 的信号中。幸运的是，BCECF 信号（或者可以轻松制作）至少比 FAD 信号强一个数量级。尽管如此，还是建议检查 BCECF 通道中检测到的是否确实是 BCECF 发出的荧光。这可以通过在不使用 BCECF 的情况下记录图像来轻松完成。

总结

本应用说明中描述的方法是代谢 FLIM 的扩展。通过与 NAD(P)H 图像并行记录 pH 图像，可以获得有关细胞和组织状态的附加信息。尽管针对基于 bh 光纤激光器的双光子系统进行了描述，但该方法实际上可用于所有 bh 多光子 FLIM 系统。所有这些系统都有两个并行的FLIM通道，带有独立的探测器和TCSPC模块，并且所有系统都使用或可以升级到SPCImage NG FLIM数据分析软件。

参考文献：

1. W. Becker, The bh TCSPC Handbook, 10th edition (2023). Available on https//www.becker-hickl.com.2. Becker & Hickl GmbH, SPCImage next generation FLIM data analysis software. Overview brochure, available on www.becker-hickl.com3. W. Becker, A. Bergmann, L. Braun, Metabolic Imaging with the DCS-120 Confocal FLIM System: Simultaneous FLIM of NAD(P)H and FAD, Application note, available on www.becker-hickl.com (2018)

4. W. Becker, C. Junghans, H. Netz, Two-Photon FLIM with a Femtosecond Fibre Laser. Application note, available on www.becker-hickl.com

5. W. Becker, L. Braun, DCS-120 FLIM System Detects FMN in Live Cells, application note, available on www.becker-hickl.com.

6. R.J. Paul, H. Schneckenburger, Oxygen concentration and the oxidation-reduction state of yeast: Determination of free/bound NADH and flavins by time-resolved spectroscopy, Naturwissenschaften 83, 32-35 (1996)

7. P.M. Schaefer, D. Hilpert, M. Niederschweiberer, L. Neuhauser, S. Kalinina, E. Calzia, A. Rueck, B. von Einem, C.A.F. von Arnim, Mitochondrial matrix pH as a decisive factor in neurometabolic imaging. Neurophotonics 4(4):045004 (2017)

8. K.M. Hanson, M.J. Behne, N.P. Barry, T.M. Mauro, E. Gratton, Two-photon fluorescence imaging of the skin stratum corneum pH gradient, Biophys. J. 83, 1682-1690 (2002)

联系方式：

Wolfgang BeckerBecker & Hickl GmbHBerlin, Germany, https://www.becker-hickl.com

Email: becker@becker-hickl.com