在传统的荧光显微镜中，荧光在整个样品深度的双锥中被激发和检测，见下图。因此，在焦平面中看到的清晰图像被焦平面上方和下方的失焦包围。对于单细胞的结构成像，这仍然是可以接受的。然而，对于FLIM来说，即使是少量的失焦模糊也是不可接受的，因为它会在焦平面的荧光衰减中增加不需要的衰减成分。对于厚组织的FLIM，情况变得完全绝望。失焦模糊变得完全不堪重负，导致图像对比度几乎完全损失，衰减成分完全混合。

失焦问题的解决方案是共聚焦检测。原理如下图所示，左图。激光束通过显微镜物镜聚焦到样品中。虽然该光束通过样品的整个深度激发荧光，但激光束焦点处的荧光最亮。来自激光束焦点的光通过显微镜透镜收集回，通过二向色镜与激光束分离，并聚焦到显微镜透镜上焦平面的针孔中。只有来自焦平面的光才能通过针孔 – 来自其他平面的光不会聚焦到针孔中，因此无法以任何明显的效率通过针孔。

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共聚焦检测的原理解决了离焦光的问题，但单独拍摄并不能提供样品的图像。为了获得物体的图像，在焦平面共聚焦检测中必须与扫描相结合。扫描可以通过不同的技术来实现，例如移动样品，移动物镜或通过快速移动的镜子偏转激光束和检测光束。第三种选择是唯一适用于生物样品成像的选项。它速度快，不会对样品施加机械力，并且可以用于任何可以放置在显微镜下的物体。共聚焦检测与光束扫描相结合，如下图所示，左图和右图所示。激光束由一对快速移动的振镜偏转。扫描透镜将光束向下投射到显微镜透镜上。随着反射镜的移动，显微镜透镜平面中的光束角会发生变化，激光聚焦在样品平面中的位置也会发生变化。荧光通过相同的光束路径返回。在振镜反射时，它形成与激光束重合的静止光束，见下图左图。荧光通过二向色镜与激光分离，并投射到与样品焦平面共轭物中的针孔中。请看下图，右。

如上所述，共聚焦检测与扫描相结合，解决了显微镜中离焦的问题。但是，扫描的作用远不止于此。它还避免了样品中散射的光导致像素之间的横向串扰。令人惊讶的是，这在显微镜文献中很少被提及。考虑一个成像系统，它同时照亮整个样品，并通过相机检测来自焦平面的图像。在此图像的所有像素中，相机将检测来自照明区域中所有其他像素的散射光，见下文左图。扫描系统 – 通过聚焦激光束扫描样品并仅检测来自激发点的光 – 仅记录来自当前像素的光（右）。即使该光的一部分散射在样品中，成像系统也会将散射光子分配给正确的像素。

横向散射光的抑制意味着已经单独扫描 – 无需共聚焦检测的帮助 – 极大地提高了光学厚样品的图像质量。下图显示了一个示例。从左到右，它显示了普通相机记录的猪皮样本的图像，通过无针孔的扫描和检测，以及通过针孔的共聚焦检测。相机图像（左）显示样品内部没有任何内容，扫描图像（中）显示内部结构，共聚焦图像（右）显示内部结构，没有失焦模糊。

BH FLIM系统使用多维TCSPC技术。这意味着，检测通过针孔的光的单个光子，确定激发脉冲周期内光子的时间和激光束在光子检测时刻的位置，并建立这些参数上的光子分布。结果是一个像素数组，每个像素都包含大量连续时间通道中的光子数。请看下图。

TCSPC-FLIM记录过程可在任何扫描速率下工作，实现近乎理想的光子效率，在每个像素中提供高分辨率的寿命衰减曲线，并达到极高的时间分辨率。信噪比仅取决于样品中可用的光子速率和总采集时间。通过向光子分布添加额外的维度，可以积累样品中的多波长FLIM图像，多激发波长图像，组合荧光/磷光图像以及快速生理效应的图像。与所有 bh FLIM 系统一样，DCS-120 TCSPC 系统具有两个平行的 TCSPC 通道，可在不同的波长间隔或不同的偏振方向下进行检测。

有关详细信息，请参阅BH TCSPC手册和DCS-120共聚焦和多光子FLIM系统手册。

原理：通过快速振镜扫描、共聚焦检测和 基于多维TCSPC 的FLIM 技术

激发：皮秒半导体激光器

扫描速率：每像素低至约一微秒

寿命图像的生成：光子到达时间分布和扫描坐标上的分布

荧光相关数据的生成： 绝对光子时间的相关性

一般操作模式：两个光谱或偏振通道中的FLIM，多波长FLIM，时间序列FLIM，Z切片FLIM，Mosaic FLIM，x，y，z，时间，激发波长复用FLIM，FLITS（荧光寿命瞬态扫描），PLIM（磷光寿命成像）与FLIM同时进行，FCS，FCCS，门控FCS，单点荧光寿命衰减记录，单点磷光寿命衰减记录

光学原理：共聚焦，通过快速振镜

扫描光束 激光输入：两个独立输入，光纤耦合

光学激光功率调节：通过中性密度滤光片轮连续可变

探测器输出：两个输出，探测器直接连接

主分光镜版本：多波段二向色镜、宽带分光镜、多光子二向色镜

次级分光转盘：三个二向色镜，偏振分光镜，100%到通道1，100%到通道2

针孔：每个通道的独立针孔轮

针孔对准：电子，通过压电位移台

针孔尺寸：11 个针孔，从大约 0.5 到 10 AU

发射滤光片：每个通道两个滤光片滑块串联

与显微镜的连接：适配器到左侧端口或显微镜顶部的端口

将皮秒激光器耦合到扫描头：单模光纤，每个激光器分开

 Ti：Sa或fs光纤激光器耦合到扫描头，多光子系统：自由光束，直径1至2 mm

扫描控制器：bh GVD-120

原理：数字波形生成，扫描波形由硬件生成

扫描图像分辨率：帧扫描 16 x 16 至 2048 x 2048 像素，线扫描 16 至 2048 像素

X 扫描：连续或逐像素

Y 扫描：逐行

激光功率控制： 软件，电信号到激光器

激光复用： 逐帧、逐行或在一个像素内

光束消隐：飞返期间和扫描停止时

扫描速率：自动选择最快速率或手动选择

扫描区域定义：通过缩放因子和偏移，或在预览期间通过光标进行交互

快速预览功能：每帧 1 秒，256 x 256 像素

光束驻停功能： 通过预览图像中的光标或FLIM图像中的光标

激光多路复用：帧、线或像素多路复用

TCSPC系统：bh Simple Tau或Power TauTCSPC系统

并联TCSPC/FLIM通道数量：2个

TCSPC / FLIM模块：SPC-150 NX或SPC-180 NX

电子间分辨率：1.5 ps RMS / 3.5 ps FWHM

最小时间通道宽度：405 fs

100 秒内的定时稳定性：优于 0.8 ps RMS

30 分钟内的定时稳定性：优于 5 ps RMS

饱和计数率：每通道10 MHz

来自检测器的输入：恒比鉴别器

来自激光的参考 （SYNC） 输入：恒比鉴别器

与扫描时钟同步：通过帧时钟、线时钟和像素时钟脉冲

扫描速率：适用于任何扫描速率

与激光多路复用同步： 通过TCSPC模块的路由功能

多波长数据记录：通过路由功能在 16 个通道中同时记录

实验触发功能：TTL，用于Z stack FLIM和显微镜控制的时间序列

TCSPC系统运行模式： Single f(t), oscilloscope, f(txy), f(t,T), f(t) continuous flow

FIFO (correlation / FCS / MCS) mode, Scan Sync In imaging, Scan Sync In with continuous flow

FIFO imaging, FIFO Imaging combined with MCS imaging, mosaic imaging, time-series imaging

multi-detector operation, laser multiplexing operation, cycle and repeat function, autosave function

显示功能（在线）：强度图像、门控强度图像、寿命图像、ROI中的衰减曲线、衰减曲线、FCS曲线、 强度轨迹。

同时显示的图像数量：8

最大图像格式，像素X x 像素 Y x 时间通道：2048 x 2048 x 256、1024 x 1024 x 1024、512 x 512 x 4096、256 x 256 x 4096

软件：数据采集软件：bh SPCM

扫描仪控制软件：集成在SPCM中

操作系统：Windows 10 64位

数据分析软件：bh SPCImage NG

数据分析原理：具有GPU处理的MLE 模型

模型函数： 单、双、三指数衰减、或单、双、三指数衰减的不完全衰减，移位分量模型。

IRF 建模：合成 IRF 函数拟合衰减数据

共聚焦FLIM的激发源：两个 BDS-SM ps 半导体激光器

可用波长：375 mm 至 785 nm

重复频率：20、50、80 MHz 和连续

脉冲宽度：40 ps 至 100 ps

探测器：HPM-100-40 混合探测器，带 GaAsP 阴极，300 至 710 nm

可选：HPM-100-06 探测器，频率为 <20 ps；FWHM IRF 宽度，300 至 600 nm

可选：HPM-100-50 探测器，400 至 900 nm

可选：多光谱MW-FLIM GaAsP 多波长探测器

DCS-120 共聚焦和多光子 FLIM 系统，用户手册，第 8 版，第 381-383 页