高分辨率图像

在过去的几年中，数据格式越来越多地转向具有更高像素数和时间通道的FLIM数据格式。较高的时间通道数量不会导致寿命精度的任何下降[6,7]，但为提取快速衰减分量提供了更好的选择，较高的像素数量产生具有更好空间分辨率的图像。由此导致的每像素光子数的减少可以通过SPCImage的重叠分束函数来补偿[6,7]。高分辨率双通道FLIM记录的示例如图2和图3所示。

图2:小鼠肾脏样本，DCS-120 MP, FLIM图像，通道<510 nm, 1024 × 1024像素，1024时间通道。下图:5×5像素区域上的衰减曲线。

图片显示的是在DCS-120 MP多光子FLIM系统的两个光谱通道中，以1024 × 1024像素和1024时间通道记录的小鼠肾脏切片(Invitrogen)[5]。5 × 5像素区域的衰减曲线如下图所示。

使用SPCImage NG进行数据分析

SPC-QC FLIM数据文件由SPCImage NG软件分析，方法与SPC数据相同[7]。

对于SPCImage NG来说，大量的像素和时间通道都不是问题。分析算法在GPU上运行，即使对于最大的图像，也可以将分析时间缩短到几秒钟。

单指数、双指数和三指数衰变模型可用。“不完全衰减”选项考虑了信号周期内的不完全衰减，最大似然(MLE)算法避免了低光子计数下的加权问题[7]。图2数据的SPCImage分析如图4 ~图6所示。采用三指数不完全衰减模型结合SPCImage合成红外光谱进行拟合。图4显示了整个SPCImage面板，其中包含幅度加权寿命tm的图像，光标位置的衰减曲线以及拟合的残差。衰减数据是干净的，平滑的残差表明拟合的高可靠性。衰减分量t1、t2、t3的寿命图像和分量a1、a2、a3的振幅图像如图5和图6所示。从这些图像中可以看出，从衰减数据中提取三指数衰减参数的精度非常高。

图4:图2数据，SPCImage NG分析。三指数拟合，振幅加权寿命图像，tm。

图5:衰减组分t1、t2、t3的寿命图

图6：衰减分量a1、a2、a3幅值图像

Express FLIM：扫描有多快，FLIM就有多快

由于其死时间短，SPC-QC-104能够以高计数率记录FLIM，因此，采集时间短。图7给出了一个例子。在8 MHz的计数率下，在1秒的采集时间内，记录了一种小蠕虫(Enchytraeus albidus)的自发荧光寿命图像。在SPCM软件的标准“FIFO成像”模式下记录图像。图像格式为512×512像素，每像素1024个时间通道。

图7:从一只活的赤翅仙身上拍摄的终生图像。自发荧光，1秒采集时间，8 MHz平均计数率，DCS-120系统，SPC-QC-104，蔡司Axio观察显微镜，x10物镜。图像面积约1mm × 1mm。在线FLIM与SPCM软件。

数据传输问题的一种解决方案是“Express FLIM”技术[1,4]。Express FLIM并不是一个光子一个光子地将数据传输到计算机中。相反，SPC-QC模块的硬件将给定像素内所有光子的信息组合成两个数字。一个是衰变曲线的第一时刻，另一个是像素内的光子数。两个数字在每个像素的末尾都被传输到计算机中[1]。即使是非常快的扫描，所需的数据传输速率也可以很容易地实现。结果是一个包含像素中强度加权荧光寿命的寿命图像。在实际应用中，Express FLIM获得的图像速率仅受共聚焦扫描头帧速率的限制。图8显示了来自200毫秒记录序列(每秒5帧)的四幅图像。

图8:活体白斑鳍的表达膜。自动荧光，5帧/秒序列中的4张图像。DCS-120系统配SPC-QC-104。光子速率约为10⁶每秒。

虽然快速FLIM的速度和图像质量令人印象深刻，但这项技术的真正魅力在于你不必使用它。SPC-QC的行为取决于您使用的软件。启动Express FLIM，您就拥有了一个快速FLIM系统，可以提供如图8所示的快速图像序列。启动SPCM, SPC-QC将作为精确FLIM模块执行，具有高时间分辨率和单个像素的完整荧光衰减数据，如图7所示。