图1：燧石中的微生物化石。bh DCS-120共聚焦扫描荧光寿命成像系统，激发波长405 nm，检测波长435 nm至650 nm。图像尺寸400 x 400 µm。物镜20倍，NA=0.5，针孔尺寸1 AU（右）。SPCM数据采集软件的在线显示功能，衰减时间采用单指数近似。

图 2：包含物体（绿色）和周围材料（红色）的感兴趣区域中的荧光衰减曲线

为了进一步了解这些神秘物体的荧光行为，我们对数据进行了 bh SPCImage NG FLIM 数据分析 [2]。图 3 展示了以此方式获得的寿命图像。从衰减参数和衰减曲线（右上和右下）可以看出，荧光衰减呈多指数衰减。从衰减曲线下方平滑的残差可以看出，三重指数模型可以很好地描述它。请注意，这些寿命与图 1 和图 2 中的不同。SPCM 使用一阶矩计算，得出寿命的单指数近似值，而 SPCImage 使用多指数模型进行 MLE 拟合，得出组分寿命的振幅加权平均值。两种方法获得的寿命必然不同。

图 3：SPCImage NG 生成的荧光寿命图像。左图：寿命图像，显示三指数拟合的振幅加权寿命 tm。MLE 拟合，GPU 计算。右上图：图像像素的 tm 直方图以及光标位置的衰减参数。右下图：光标位置的衰减曲线。图像格式为 512 x 512 像素，每个像素有 1024 个时间通道。

图4：通过相量图进行图像分割，选定具有细胞相量特征的像素。右下方显示选定像素的组合衰减曲线。

图5使用相同的程序来选择具有与细胞不同的相量特征的像素。组合衰减曲线显示在右下方。衰减分量分别为334 ps、2534 ps和7794 ps，振幅分别为0.5924、0.2534和0.1096。

图5：通过相量图进行图像分割，选定的像素与细胞的相量特征不同。右下方显示了选定像素的组合衰减曲线。

燧石形成于中生代，距今约1.5亿至6000万年。人们认为，它是由富含硅的流体填充沉积物中的空腔（例如甲壳类动物或软体动物钻出的孔洞）而形成的。随着时间的推移，流体中的硅酸含量不断增加，胶凝化，最终凝固成隐晶质二氧化硅[5, 6]。可以想象，最初的流体中可能存在细菌。然而，硅化是一个缓慢的过程。目前尚不清楚细菌如何在日益恶劣的环境中存活如此长时间，或者至少在形态上保持完整。另一种可能性是，细菌在石头已经形成时就侵入其中。然而，我们的图像并未显示材料中可能存在裂缝或孔隙，而这些裂缝或孔隙正是细菌入侵的途径。总而言之，最有可能的解释是，我们看到的确实是中生代细菌的遗迹。如果这是正确的，那么使用激光扫描 FLIM 显微镜对燧石进行检查可能成为研究古代微生物的一种有趣的技术。

1.   W. Becker, The bh TCSPC handbook. 10th edition (2023), available on www.becker-hickl.com

2.      W. Becker, A.Bergmann, SPCIMage NG FLIM data Analysis. In: W. Becker, The bh TCSPC handbook. 10th edition (2023), available on www.becker-hickl.com

3.    Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal and Multiphoton Scanning FLIM Systems, user handbook 9th ed. (2021). Available on www.becker-hickl.com

4.      Y. Chmykh, J. L. Nadeau, The use of fluorescence lifetime imaging (FLIM) for in situ microbial detection in complex mineral substrates. J. Microsc. 294, 36–51 (2024)

5.      Flint.https://en.wikipedia.org/wiki/Flint

6.      Flint and Chert. http://www.quartzpage.de/flint.html