色氨酸荧光

色氨酸 (TRP) 荧光寿命成像的问题在于激发和发射波长均在紫外区。激发波长最大值约为 280 nm，发射波长范围从约 300 nm 延伸至 400 nm [9]。色氨酸的吸收和发射光谱如图 2 所示。

图 2：色氨酸的吸收光谱（左）和发射光谱（右）（源自[9]）

另一种可能性是通过双光子（2p）激发色氨酸。色氨酸的最佳激发波长范围为530至560 nm。NADH或FAD在此波长下没有明显的吸收，见图3。因此，可以预期光损伤将保持在可接受的水平。直到最近，问题在于还没有合适的、具有所需波长的飞秒激光器。现在，波长为540 nm的飞秒激光器已经问世[11]。这促使我们尝试利用2p激发对色氨酸进行双光子荧光显微成像（FLIM）。

图3：多光子激发TRP。红色：825 nm激光。绿色：825 nm激光。可以看出，825 nm的3p激发也能激发FAD。540 nm的双光子激发不存在此问题。

双光子色氨酸荧光免疫荧光系统

我们的色氨酸系统基于Becker & Hickl 标准的DCS-120 MP多光子荧光显微成像系统。其原理如图4所示。

图4：双光子色氨酸FLIM系统的光学原理

光学部分由 bh公司 DCS-120 共聚焦扫描头 [ 4 ]、尼康 Ti-2E 显微镜、带 SHG 选项的 560 nm VALO Aalto 飞秒激光器（德国HÜBNER Photonics公司） [11] 和两个 HPM-100 混合型单光子探测器 [3] 组成。其原理如图 4 所示。激光器在 540 nm 的波长下输出 50 mW 的光功率。激光束经过一个快门和一个可变衰减器。扫描由 DCS-120 MP 共聚焦扫描头进行。扫描头的扫描透镜将激光束沿着显微镜光束路径投射到显微镜镜头。[3, 4]。为了获得高激发和检测效率，我们使用了 40X NA=1.3 油浸物镜。荧光通过显微镜镜头收集回来，通过显微镜滤光片转盘中的 520 nm 二向色分束器与激发光分离，并通过显微镜后端口发出。光线通过常规 NDD（非扫描检测）光束路径 [3] 传输到单光子探测器。散射激光由 500 nm 短波通滤光片滤除。DCS-120 系统有两个单光子探测器。为了记录色氨酸，我们只使用了其中一个。检测到的信号进一步通过 360/40 带通滤光片净化。信号由 bh 的多维 TCSPC FLIM 工艺 [2, 3, 5] 通过 DCS-120 系统的两个 SPC-180NX FLIM 模块 [3] 之一记录。更多详情，请参阅 [ 3,4 ]。

结 果

图5为活酵母细胞色氨酸荧光寿命图像。样品平面激发功率为2 mW，采集时间为60秒。计数率为9 × 10⁴ 个光子/秒，在此时间内采集了5.5×10⁶个光子。该光子数量足以进行双指数衰减分析。光标位置处的衰减组分分别为632 ps快寿命组分（占比49%）和3525 ps慢寿命组分（占比51%），振幅加权寿命为2108 ps。

图5：酵母细胞色氨酸荧光寿命成像。左图：寿命图像。双指数衰减的振幅加权寿命。右图：光标位置的衰减函数。图像格式：512 x 512像素，1024个时间通道，540 nm双光子激发，寿命范围：1000 ps至4000 ps。使用bh SPCImage NG 9.0软件进行分析[6]。

图6展示了活体大肠杆菌（E. coli）的色氨酸荧光寿命图像。大肠杆菌并非易事，它们体型较小，移动速度很快。该图像的采集时间为90秒。整幅图像包含约1000万个光子。采用双指数衰减模型对图像进行分析。光标位置处的衰减组分分别为1573 ps快寿命组分（占比62.7%）和4740 ps慢寿命组分（占比37.3%）。振幅加权寿命为2762 ps。

图6：大肠杆菌中色氨酸的荧光寿命成像（FLIM）。左图：寿命图像。双指数衰减的振幅加权寿命。右图：光标位置的衰减函数。512 x 512像素，1024个时间通道，540 nm双光子激发，寿命范围为1000 ps至4000 ps。使用bh SPCImage NG 9.0软件进行分析[6]。

为了进行比较，图7显示了色氨酸在水溶液中的衰减曲线。该数据采用与上述FLIM数据相同的系统采集，该曲线是通过将单条衰减曲线中所有像素的数据合并而创建的[6]。

图7：色氨酸在水中的衰减曲线。采用与FLIM图像相同的系统记录。采集时间为160秒，使用bh SPCImage NG 9.0软件进行分析。

2463 ps 的组分占比为 64.8%，3192 ps 的组分占比为 35.2%，衰减接近单指数。振幅加权寿命为 2719 ps。这些值与从酵母细胞和大肠杆菌细胞中获得的寿命相符。这有力地表明，细胞中的发射实际上来自色氨酸。细胞中的衰减函数更接近双指数（a 1 高于溶液中，t 1低于溶液中），这可以通过 TRP 环境的异质性以及可能通过从 TRP 到 NADH 的 FRET 来解释。FRET 已在 PCa 细胞中发现 [1]，并且似乎也发生在酵母和大肠杆菌细胞中。尝试计算酵母细胞中假设的FRET效率，得到了如图8所示的FRET图像。左侧是经典FRET效率[7]的彩色编码图像，右侧显示了光标位置处的FRET效率分布和衰减参数。最常见的FRET效率为0.46，这对于TRP-NADH FRET来说是一个合理的值。

图 8：假设的 TRP-NADH 能量转移的 FRET 图像。左图：图像显示颜色编码的（经典）FRET 效率。右图：FRET 效率在像素上的分布以及光标位置处的衰减参数。使用 bh SPCImage NG 9.0 软件进行分析。

总 结

我们介绍了一种可记录活细胞中色氨酸 (TRP) 荧光寿命图像的荧光寿命成像 (FLIM) 系统。该系统基于标准 bh DCS-120 MP 多光子荧光寿命成像 (FLIM) 系统 [4]。与已知的三光子方法不同，该系统采用新型 540 nm飞秒激光器（德国HÜBNER Photonics公司）进行双光子激发 [11]。这样可以避免 NADH 和 FAD 的不必要激发造成的光损伤。我们通过记录大肠杆菌细胞和酵母细胞的 TRP 图像演示了该系统的使用。样品平面的激发功率约为 3 mW，TRP 发射带的计数率约为每秒 90,000 至 100,000 个光子。衰减函数呈双指数函数，酵母细胞的寿命组分为 632 ps 和 3525 ps，大肠杆菌细胞的寿命组分为 1573 ps 和 4740 ps。 TRP在溶液中的寿命组分分别为2463ps和3192ps。