为多光子成像装置寻找理想的超快激光源并非易事。它是峰值功率、脉冲能量和激光波长之间的精细平衡。在这篇白皮书中，我们讨论了重要的激光参数以及这些激光参数对结果质量的影响。 背景 多光子和高阶谐波生成显微镜特别适用于高分辨率三维和活细胞成像，其中单光子技术受到离焦荧光背景和穿透深度的限制。基于多光子相互作用的成像技术，如两个或三个光子激发和高阶谐波生成，如二次或三次谐波生成（SHG或THG）成像，已成为许多生物医学研究或临床诊断应用中非常有吸引力的工具，因为它们提供了具有减少组织损伤的高对比度成像能力，而不一定需要人工诱导的荧光染料。 为了发生多光子激发，入射光子必须在同一时间和地点到达样品，以增加单个荧光化合物同时发生多光子吸收事件的概率，这意味着多光子激发的效率在很大程度上取决于脉冲期间入射光的峰值强度。因此，脉冲越短，峰值强度越高，产生的信号越强。 由于多光子显微镜和高阶谐波成像中对光强度的非线性依赖性，信号也仅从焦平面内收集，激发光几乎不产生离焦发射。由此产生的受限多光子激发体积特别适用于活细胞成像，因为它导致更高的深度分辨率和明显更少的样品光损伤，从而延长了细胞的生存能力。 此外，多光子成像中使用的较长波长由于散射较低而增加了对样品的穿透深度。因此，多光子显微镜在需要对活细胞和组织进行深度穿透和成像的实验中通常优于其他技术。多光子激发和高阶谐波成像需要高峰值强度，这就要求使用具有超短飞秒脉冲的锁模激光器。为了触发大量多光子吸收事件，脉冲期间的光子密度必须比单光子吸收中的光子密度大几个数量级。先前发表的结果[1，2]表明，即使比通常使用的100-200fs的脉冲持续时间更短的脉冲，也能降低细胞致死率，并允许进行更长期的活细胞成像。在这篇白皮书中，我们展示了使用50 fs以下的脉冲激光器可以产生非常明亮的多光子和高阶谐波图像，同时保持平均值。 成像深度–更长波长？ 三维成像中的初始考虑之一是在选定的激光波长下的样品透明度。在大多数组织中，由于组织的不均匀性，穿透深度受到光散射的限制。 光在各向异性介质中散射，但较长的波长比较短的波长经历较少的散射，因此允许更深的光学切片、更大的穿透深度和对厚样品的三维成像。光散射（瑞利散射）的标度为1/λ^4，这意味着在1050