移动细菌的无标签多光子FLIM

Wolfgang Becker, Axel Bergmann, Julius Heitz, Becker & Hickl GmbH, Berlin, Germany

摘要：活细菌通常很难在自然环境中成像，因为它们极易移动。为了获得合理的图像质量，必须使用极短的图像采集时间，然而，这导致像素光子数不足以进行精确的寿命分析。更高的激发功率并不能解决这个问题，因为它会损害细菌的生存能力，甚至导致严重的光损伤。因此，我们开发了一种技术，可以记录一系列快速单帧图像，通过相量分析识别这些图像中的细菌，并将相应像素的光子组合成高光子数的单个衰减曲线。该曲线通过时域中的多指数衰减分析进行处理，得到细菌的精确多指数衰减参数。

自体荧光FLIM
生物材料含有许多可用于荧光成像的荧光化合物。最有趣的是NAD（P）H（烟酰胺腺嘌呤（吡啶）二核苷酸）。NAD（P）H不仅参与细胞的代谢，其荧光还取决于代谢的类型。这种效应很难通过光谱成像看到，但可以通过FLIM可靠地解决。然后，它通过不同数量的快速和缓慢衰减荧光来显示自己[1，13，18]。因此，NAD（P）H FLIM-或NAD（P）H FLIM与FAD FLIM结合-也称为“代谢FLIM”[5，6]。它被用于大量生命科学应用[11，12，15，17，19]。有关文献概述，请参见[1]。唾液链球菌的FLIM图像如图所示。1。寿命衰减曲线显示了NAD（P）H的典型多指数行为。快速成分的衰减时间为361ps，来自游离NAD（P）H。慢荧光分为1.96ns和5.395ns两个组分，来自结合的NADPH和结合的NADH[10]。

图1：唾液链球菌的NADH FLIM图像。bh DCS-120 MP FLIM系统，激发波长为785 nm，检测波长为440 nm至480 nm。右侧显示了光标位置处的衰减曲线和衰减参数。

NAD（P）H成像需要340至380nm的激发波长。如此短的波长在显微镜下很难处理。光学系统的传输远不理想，并且存在较大的像差，从而影响空间分辨率。因此，通常采用双光子激发进行NAD（P）H 的FLIM成像。此外，代谢FLIM必须在代谢完整的活细胞和组织上进行。因此，适用的激发功率非常有限，并且荧光强度低。原则上，这对于bh的TCSPC FLIM[1，2]来说是没有问题的。该技术的时序稳定性如此之高，以至于从技术上来说，采集时间实际上是无限的。因此，通过简单地延长获取时间，总是可以获取足够数量的光子。对于中等寿命精度和低像素数，典型的采集时间在10秒到几分钟之间。这不是很长，但如果样本中感兴趣的对象正在移动，可能会导致问题。

问题
实时样本中的运动是任何FLIM用户的噩梦。为了获取足够的光子进行精确的衰变分析，必须累积大量的帧。只要样本中的对象在整个采集时间内保持原位，这就没有问题。然而，如果被调查的物体像细菌一样在移动，图像就会被抹去，细菌的衰变数据会与来自底物的信号混合。在这些情况下，第一个想法通常是提高激发功率，从而增加光子通量。然后将在更短的采集时间内达到衰减数据的给定精度。不幸的是，这种方法的选择非常有限。高激发功率很快会对样品造成侵入性影响，甚至造成灾难性损伤，使FLIM结果变得无用。这在细胞发射微弱的自体荧光实验中尤其如此。

一个例子如图所示。2.图像显示了培养的底物上的活大肠杆菌。数据用bh DCS-120 MP光纤激光系统在785 nm激发波长下记录。细菌极易移动。在1.5秒的采集时间记录下，细菌仍然在边缘可见（左图）。然而，像素中的光子数不足以进行多指数衰减分析。图2中显示的另一个问题是底物的背景荧光。对于不动物体，它受到双光子激发过程的深度分辨率的抑制。然而，对于在采集期间移动的物体，背景的荧光与物体的荧光混合。

图2：左：大肠杆菌细菌培养，1.5秒持续时间的单次扫描。细菌几乎是可见的，但没有足够的光子进行精确的寿命分析。右：相同的样本，采集时间为24秒。每个像素有足够的光子，但运动使细菌不可见。
随着采集时间增加到24秒（图2，右侧），运动完全模糊了图像细节。只有不动的细菌仍然可见。这些细菌的寿命异常长。它们可能不是可行的，因此不值得进一步调查。

如上所述，通常试图通过更高的激发功率来解决该问题。当然，更高的激发功率产生更高的荧光光子速率，从而在更短的时间内产生更好的图像。但这是有代价的。图3显示了激发功率增加2.5倍的记录。这导致光子速率增加6.52倍。毫无疑问，细菌比图中更清晰可见。2，但出现了大量寿命极短的斑点（图中为红色）。这些是烧伤痕迹，表明发生了严重的光损伤。当然，仍然有细菌看起来完好无损。然而，由于附近存在严重的光损伤，寿命衰减数据，尤其是从它们获得的代谢信息是不可信的。

图3：激光功率增加2.5倍时的FLIM记录。超短寿命的红色斑点表明样品损坏。SPCM的在线寿命显示，红色到蓝色=1 ns到4 ns。

图2和图3所示的问题导致了对更快FLIM技术的需求雪崩。这些解决方案被设计为在高光子通量下工作，但以牺牲光子效率为代价[4，14]。当然，该方法并不成功，导致FLIM不是一种适合分子成像的技术。当然，这是错误的。错误在哪里？
采集速度的限制在于样品传递高光子速率的能力，而不是FLIM技术的计数能力。以光子效率为代价增加计数能力会使情况变得更糟。需要更多的光子才能达到给定的精度水平，其结果是损伤效应变得更加严重。除非样品非常明亮和稳定（在分子成像应用中并非如此[1]），否则TCSPC FLIM是并且仍然是最快的技术，因为它比“快速”FLIM技术需要更少的光子。

解决方案

基于相量图的图像分割

那么，如何解决样本中的运动问题呢？显然，不是使用更快的FLIM技术。从移动细菌中获取衰变信息的一种可能方法是记录一次快速扫描，识别图像中的细菌，并汇总位于细菌内部的所有像素的寿命衰减数据。
如何在一次扫描的图像中识别细菌？一种简单（且容易获得）的方法是bh的SPCImage NG FLIM数据分析的相量图，请参见[1，7，9]。相量图对像素中衰减数据特征的差异非常敏感。具有相似衰减特征的像素在相量图中彼此靠近。即使光子数对于逐像素分析来说太低，细菌的相量范围也可以被识别。然后，操作员标记感兴趣的相量范围，并在图像中对相应的像素进行反向注释。将这些像素中的衰减数据相加，并通过正常时域拟合程序分析所得曲线。

该过程如图4所示。左侧显示了一幅单帧图像。正如预期的那样，标准的寿命分析无法提供细菌的精确荧光寿命衰减数据，请参见右下角的寿命衰减数据。然而，SPCImage NG的最大似然拟合在图像中提供了近似的寿命（以颜色表示）。相量图（右上）显示了扫描各个像素的相量值云。选择与细菌颜色相同的一系列相量（比较左侧的FLIM图像）选择细菌内部的像素。