Wolfgang Becker, Axel Bergmann, Markus Schubert, Stefan Smietana
Becker & Hickl GmbH
摘要：当计数率接近TCSPC电子器件的死时间倒数（最大计数率）时，FLIM图像像素中的光子数成为强度的非线性函数。因此，图像在明亮区域的对比度降低，而单个像素中的衰减数据保持正确。为了提高高计数率下的图像质量，我们在TCSPC定时电子设备并行安装了一个计数器。计数器提供几乎没有计数损失的像素光子数。bh的SPCM软件的一种新的“寿命/强度”模式通过使用并行计数器的像素强度和定时电子设备的像素衰减数据来建立FLIM图像。这些图像在高计数率下显示出显著改善的对比度。该模式适用于SPC-160和新的SPC-180 TCSPC/FLIM模块。

高计数率下的TCSPC的强度等级

以高计数率拍摄的TCSPC FLIM图像通常看起来很难看，对比度通常不够理想，突出细节明显缺失。这种效应的来源不是人们通常认为的“堆积”效应。堆积会将记录的寿命更改为较低的值。然而，在数据中没有发现记录寿命的减少。这是可以理解的：记录寿命中的误差保持在5%以下，直到计数率达到激发脉冲频率的20%[1,2]。这意味着，对于80 MHz的激光重复频率，可以使用超过10 MHz的计数率。在FLIM测量中很少遇到如此高的计数率。

结果表明，高计数率下对比度差的原因是TCSPC过程的死时间造成的计数损失。计数损失会导致强度标度的非线性[1,2]。计数数对强度的作用在高强度时趋于平缓，最终达到饱和。这种效果是图像明亮部分的对比度降低。这正是观察到的情况。

对于大多数FLIM应用来说，强度标度的非线性是一个纯粹的美学问题：信息来自衰减曲线的形状，而不是像素中的强度。因此，牺牲时间分辨率或光子效率以获得低死区时间的仪器解决方案是不合适的[4]。bh FASTAC FLIM系统[5]在不损失时间分辨率的情况下达到极低的死区时间。然而，技术上的努力是很高的，通常不足以解决纯粹的美学问题。

在BH SPC-160和最近的SPC-180 TCSPC模块中实现了强度非线性问题的简单解决方案[6]。这些模块采用了一个并行计数器，绕过TCSPC定时电子设备。它直接在探测器CFD的输出端对脉冲进行计数，并将每个像素的计数器结果放入参数标签数据中。该计数器的死区时间可以忽略不计——它主要由探测器和CFD死区时间决定。这大约是5纳秒。FLIM图像是通过使用计数器结果作为像素强度，并将来自TCSPC定时电子设备的数据作为像素衰减曲线来建立的。新的FLIM模式可用于SPC-160和新的SPC-180系列TCSPC模块。

示例

图1中展示了图像改善的示例。使用SPC-180NX TCSPC模块，使用DCS-120共聚焦FLIM系统[3]记录图像。样本为染色的小鼠肾脏切片（Invitrogen F24630）。激发波长为480nm，检测波长范围为500～680nm。这些图像以512 x 512像素的分辨率记录，每像素1024个时间通道。图像上记录的平均计数率为5.6 MHz。左边的图像由新的寿命/强度模式创建，右边的图像由传统的FLIM模式创建。在这两种情况下，都使用了SPCM softw are[1,7]的在线寿命显示功能。

图1：Invitrogen F24630标记小鼠肾脏切片记录的FLIM图像。左图：新的寿命/强度模式。右图：传统的FLIM模式。512 x 512像素，1024个时间通道，SPCM软件的在线寿命显示功能。寿命范围从2000ps到4000ps。平均（记录）计数率5.5 MHz。

在SPCM软件中的实现和参数设置

寿命/强度模式可在SPCM数据采集软件，2021年6月8日或以后的版本9.86中获得。用户界面的实现和参数设置如图2和图3所示。在“系统参数”中，单击“配置”并启用“强度图像/构建图像”。这将启用并行计数器，将像素强度放入光子数据流，并指示软件建立像素强度阵列。

图2：通过并行计数器通道进行强度成像的系统参数。SPCM建立由并行计数器记录的像素强度阵列。

在3D Trace parameters（可通过“Parameters”或在图像窗口中单击鼠标右键访问）中，选择“Lifetime+Intensity”作为数据类型，见图3。您可以为一个通道或同时为多个通道选择“Lifet+I”。在图3中，它已被设置为显示窗口1，显示窗口2显示由SPCM的在线寿命功能创建的“正常”寿命图像[1，7]。第二个TCSPC模块M2的图像已关闭。通过显示设置，SPCM显示图1所示的两幅图像。

图3：使用并行计数器的强度值，可以建立寿命/强度图像

采用SPCImage-NG数据分析软件分析数据

寿命/强度数据的分析在SPCImage NG 8.4版或更高版本中实现。数据分析是以通常的方式进行的[1,8]。在感兴趣的SPCM显示窗口中单击鼠标右键，然后选择“Send Data to SPCImage”，或单击“Main”和“Send Data to SPCImage”。SPCImage识别数据为寿命/强度数据，并相应地进行处理。这意味着，衰减曲线取自正常的FLIM数据阵列，但强度来自平行计数器通道创建的像素光子数阵列。要开始数据分析，请选择适当的衰减模型，然后通过“Caculate”、“Decay Matrix”开始数据分析流程。图1左侧数据的结果如图4所示。

图4:SPCImage NG对寿命/强度数据的分析。双指数衰减的平均寿命，tm，寿命范围从1400 ps到2500 ps。

总结

SPCM 9.86版的寿命/强度模式与BH SPC-160和SPC-180系列TCSPC模块结合使用，以线性强度比例记录FLIM图像，直至TCSPC定时电子设备的饱和计数率。这是通过在与TCSPC定时电子设备并行的快速计数器中计算光子来实现的。从计数结果得出的像素强度没有计数损失。数据可通过SPCM的“Lifetime”显示功能显示。为了进一步分析，可以用通常的方式将数据发送到SPCImage NG。SPCImage自动将数据识别为寿命/强度数据，并以线性强度比例显示。

参考文献

1. W. Becker, The bh TCSPC handbook. 8th edition (2019), available on www.becker-hickl.com
2. W. Becker, Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 2005
3. Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal and Multiphoton Scanning FLIM Systems, user handbook 8th ed. (2019). Available on www.becker-hickl.com
4. X. Liu, D. Lin, W. Becker, J. Niu, B. Yu, L. Liu, J. Qu, Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Heaalth Sciences, 1930003-1 to -27 (2019)
5. Fast-Acquisition TCSPC FLIM System with sub-25 ps IRF width. Application note, available from www.beckerhickl.com
6. SPC-180 NX High-Resolution Time-Correlated Single Photon Counting Module, Data sheet, available on www.becker-hickl.com
7. Becker & Hickl GmbH, SPCM Software Runs Online-FLIM at 10 Images per Second. Application note, available on www.becker-hickl.com
8. Becker & Hickl GmbH, SPCImage Next Generation FLIM data analysis software. Overview brochure, available on www.becker-hickl.com

联系我们

Wolfgang Becker
Becker & Hickl GmbH
Berlin, Germany
Email: becker@becker-hickl.com